王晓宇，陈啸飞，顾妍秋，曹岩，原永芳，洪战英，柴逸峰
第二军医大学药学院药物分析学教研室
上海市药物（中药）代谢产物研究重点实验室
医院北院药剂科
1引言细胞膜色谱(Cellmembranechromatography,CMC)是近年发展迅速的一种生物亲和色谱技术,以细胞膜与色谱载体作为固定相,采用色谱分析法,可在体外模拟药物分子与细胞膜受体的相互作用过程。细胞膜色谱法将复杂成分分离与化合物活性筛选结合,具有操作方便、快速稳定、灵敏度高等优点,尤其适用于中药等复杂体系的活性成分筛选。该技术自发明以来,经过方法学的不断改进与完善,发展了近30种细胞膜色谱模型,成功应用于40余种中药或复方的活性成分筛选,同时应用于研究药物-受体相互作用。本文对细胞膜色谱技术的研究进展及其在中药活性成分筛选中的应用进行详细综述。
2细胞膜色谱法的原理细胞膜色谱法由西安交通大学贺浪冲教授课题组于年首次报道,是一种以具有活性的细胞膜受体为固定相的仿生亲合色谱技术,此技术利用细胞膜自身的融合作用和硅胶表面硅羟基(Si-OH)的吸附作用制备成细胞膜色谱固定相(Cellmembranestationaryphase,CMSP),最大限度地保持了细胞膜的完整性、膜受体的空间结构以及生物活性。细胞膜色谱固定相示意图如图1A所示,中心红色球体代表硅胶,周围橙色代表细胞膜的磷脂双分子层,蓝色代表细胞膜上的蛋白或受体,细胞膜和硅胶载体之间以氢键吸附作用结合,键合细胞膜后的硅胶载体扫描电镜图像如图1B所示。以K+,Na+-三磷酸腺苷(K+,Na+-ATP)酶作为活性指标,测定结合硅胶后的细胞膜、混悬液状细胞膜和沉淀状细胞膜,这三者之间酶活性无差异,可见硅胶可作为细胞膜的理想载体;细胞膜色谱固定相具有色谱分离和活性表征的双重功能,广泛应用于复杂体系药物活性成分的筛选分析以及药物与膜受体相互作用分析。
3细胞膜色谱法方法学研究进展细胞膜色谱技术自建立以来得到了广泛应用,但仍然存在一些问题有待解决。首先,柱寿命短,其主要原因在于附着在硅胶上的细胞膜蛋白容易脱落或失去活性,影响了筛选结果的稳定性和重现性。其次,对细胞膜色谱柱的制备质量缺乏一个较为统一的评价标准,这使得不同细胞膜色谱柱之间质量差异较大,难以获得理想的重现性。此外,细胞膜色谱作为一种生物色谱,其本身的柱效和理论塔板数都较低,因此,细胞膜色谱与二维色谱串联质谱的联合使用大大提升了其作为筛选工具的适用性和通量。
图1细胞膜色谱固定相:(A)示意图;(B)表面扫描电镜图
3.1细胞膜色谱柱制备条件优化本课题组Ding等对细胞膜色谱柱的制备过程中3个关键步骤(细胞用量、细胞破碎和装柱流程)进行了方法学考察和优化,使细胞膜色谱柱压更稳定、柱效更高,并对细胞膜色谱模型的制备过程进行了全面考察,建立起了一系列质控标准,为实验室制定了该项技术的标准化操作流程,有效提高了细胞膜色谱模型制备的重现性。
细胞膜色谱柱在使用过程中,细胞膜表面的受体蛋白在使用过程中可能会发生失活,逐渐失去其原有的生物活性;另一方面,固定相表面结合的细胞膜容易在流动相的冲洗下脱落,以上两个原因导致细胞膜色谱柱的柱寿命较短,一般连续使用48~72h后即失效。Ding等采用多聚甲醛处理键合了细胞膜的固定相,多聚甲醛可以与蛋白表面氨基交联,同时使膜蛋白容易保持其空间构型,经此处理后细胞膜与硅胶的结合稳定性得到显著提高。然而,多聚甲醛作为一种蛋白交联剂,可能会导致蛋白结构破坏,活性下降,不能保证筛选结果的可靠性。因此,需要建立一种在不损伤细胞膜的同时,又能提高细胞膜在硅胶载体上的附着力的新方法。
Ding等制备了一种3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane,APTES)修饰的硅胶,并应用于细胞膜色谱的制备过程中,改变传统的细胞膜和硅胶载体之间主要靠氢键和范德华力的非共价结合模式,实现了硅胶载体和细胞膜之间以共价键结合。如图2所示,其原理是以APTES为桥梁,连接一个戊二醛增加连接臂长度,在硅胶表面键合了醛基基团,而细胞膜是由丰富的磷脂组成的,含有大量氨基基团,因此键合在硅胶表面的醛基与细胞膜上氨基在室温环境中易发生醛氨缩合反应,以共价键的形式结合,这大大提高了细胞膜在硅胶表面的附着力,同时又避免了对膜蛋白结构的破坏。该方法提高了细胞膜在硅胶载体表面的稳定性,降低了细胞膜脱落概率,有效延长了细胞膜色谱柱的使用寿命,从原有的不足3天延长到12天以上,此外,在柱活性下降最快的前3天,阳性药吉非替尼的保留时间RSD也由20%下降到低于10%,重现性显著提高。采用该方法制备的细胞膜色谱柱可用于一些难以培养、较难获得的珍稀细胞,建立的模型可延长细胞膜生物活性,显著提升了稳定性,提高了细胞膜色谱柱适应性。
图2经APTES修饰的细胞膜色谱固定相示意图
3.2细胞膜色谱分析系统优化随着分析仪器和分析方法的发展和进步,细胞色谱分析系统也得到了不断的更新和提升,从最开始的单维细胞膜色谱分析系统到“中心切割”二维细胞膜色谱分析系统,以及近年发展的全二维细胞膜色谱分析系统。单维细胞膜色谱分析系统无法对筛选得到的结果直接进行分离和鉴定,在后续的分析过程中可能会丢失一些信息。而“中心切割”二维细胞膜色谱分析系统具有自己的分析鉴定系统,弥补了单维细胞膜色谱分析系统的不足,同时由离线发展到在线,减少了分析步骤,缩短了分析时间。而全二维细胞膜色谱分析系统可以同时实现在线、全自动的分析过程,并可对细胞膜色谱柱中所有的组分进行分离分析。
3.2.1单维细胞膜色谱分析系统单维细胞膜色谱分析系统,可以用细胞膜色谱柱作为分离分析系统,根据化合物在细胞膜色谱图上的保留行为,筛选出潜在活性成分。单维细胞膜色谱分析系统如图3所示,将复杂体系的样品进样到细胞膜色谱中,根据细胞膜色谱的分离分析功能将样品进行分离,在由检测器给出保留行为图谱。赵小娟等制备了犬血管细胞膜色谱,对淫羊藿根与叶的活性成分进行了分析比较,结果表明,淫羊藿根乙醚提取物在细胞膜色谱上有保留行为。进一步将淫羊藿根乙醚提取液用高效液相色谱分离得到17个样品,再用细胞膜色谱对该17个样品进行分析,结果表明,有2个成分(YYH-,YYH-)和阳性药维拉帕米一样能在细胞膜色谱系统上产生保留行为。张汉利等应用大鼠血管和心肌细胞膜色谱筛选出太白花中含有对主动脉血管有舒张作用、对心肌收缩有抑制作用的有效成分。高琨等采用大鼠血管细胞膜色谱筛选出红毛七中对主动脉血管有舒张作用的有效成分。该方法的不足之处在于无法对筛选得到的有效成分进行直接分离和鉴定,需借助另一种分析系统进一步对有效部位进行分离分析,步骤繁琐耗时,第一维色谱的信息有所丢失。
图3单维细胞膜色谱分析系统示意图
3.3.2“中心切割”二维细胞膜色谱分析系统鉴于细胞膜色谱本身分离效能的局限性和检测系统单一性的问题,单维细胞膜色谱分析系统无法同时做到对有效活性组分的高效分离、快速识别和准确鉴定,因此需借助快速的分离系统和高灵敏的检测系统对活性组分进行进一步的分离鉴定。为了实现自动化分析筛选活性成分,研究者发展了一种离线“中心切割”二维色谱离线分析方法,该方法的原理是将第一维的组分通过检测器识别后,将潜在的活性组分分别收集,离线导入第二维液相色谱串联质谱(HPLC-MS)或气相色谱串联质谱(GC-MS)进行离线分析。如文献采用血管内皮细胞膜色谱-GC-MS方法筛选白芷、羌活、北沙参、蛇床子和五味子,发现欧前胡素、蛇床子素和五味子甲素对血管平滑肌细胞有舒张作用。文献采用腹腔巨噬细胞膜色谱-GC-MS方法筛选白术和罗田苍术,发现白术内酯I对腹腔巨噬细胞有抗炎作用。然而,这种离线二维方法需要对色谱流份进行收集和富集,步骤较为繁琐,耗时较长。研究者又发展了一种“中心切割”二维细胞膜色谱在线分析系统,样品通过细胞膜色谱柱分离后可直接进入MS系统进行识别和鉴定,大大减少了工作量,缩短了分析时间,实现了实时在线监测分析,如CMC-online-HPLC/MS。Li等建立HEK/VEGFR-CMC-online-HPLC/MS方法筛选乌头中作用于VEGFR-2受体的抗癌活性成分有中乌头碱、乌头碱和次乌头碱。Sun等建立A/CMC-online-HPLC/MS方法筛选红毛七总生物碱中作用于人EGFR受体活性成分有塔斯品碱和红毛新碱。Wang等建立α1AAR-CMC-online-HPLC/MS方法筛选红毛七中作用于人α1A-肾上腺素受体的活性成分有木兰花碱和红毛新碱。Wang等建立A/CMC-online-HPLC/MS方法筛选苦参中EGFR受体拮抗剂有氧化苦参碱和苦参碱。Ren等建立Prostate/CMC-online-HPLC/MS方法筛选莲子心中作用于α1A-AR受体的具有抗前列腺癌作用的活性成分有莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱。研究表明,在线二维细胞膜色谱技术为中药复杂体系中活性成分的快速筛选、同分异构体的表征、动物摄取中药后体内代谢产物的检测提供了一种高效、快速、适用性强的方法体系。
3.3.3全二维细胞膜色谱分析系统目前,“中心切割”二维细胞膜色谱模式仍存在下列问题:(1)第一维紫外检测器的识别可能忽略一系列低紫外吸收的活性成分;(2)第二维使用常规的HPLC或GC-MS需要较长的分离分析时间;(3)常规质谱定性能力弱,一般需要对照品来鉴别非靶标组分,而中药复杂成分标准品较难获得,从而影响了细胞膜色谱分析的通量和准确度。为解决上述问题,本课题组发展了一种新的全二维细胞膜色谱分析系统。Chen等首次建立全二维HepG2肝癌/CMC/整体柱/TOFMS分析系统,并应用于筛选黄柏和苦参中抗肝癌活性成分,该系统组成如图4所示。全二维系统的第一维色谱是细胞膜色谱柱,由一个单元泵输送流动相10mmol/L醋酸铵溶液,第二维色谱是反相色谱柱,由一个二元泵负责输送流动相,实现梯度洗脱。为实现第一维与第二维色谱同步分析,用一个十通阀将这两维色谱桥连起来,并设置为每隔2.5min进行自动切换。在A和B状态的不断切换过程中,第一维细胞膜色谱柱的全部组分都能够进入到第二维色谱分离柱中进行分离,并串联高分辨的飞行时间质谱仪(TOF/MS)进行数据采集和分析。在此全二维系统中,第一维组分可以全部流入第二维色谱柱中进行进一步的分离分析,因此,无需对第一维的组分进行鉴定和表征,可利用第二维分离柱-TOF/MS强大的分离和鉴定能力,结合MATLAB工作站的数据处理和绘图功能对有亲和活性的组分进行快速表征和鉴别,成功弥补“中心切割”二维色谱的一些缺陷和不足。在此基础上,Chen等建立正常/阿霉素诱导心衰比较全二维CMC/整体柱/TOF-MS方法筛选附子中抗阿霉素诱导的心力衰竭的活性成分,通过构建正常大鼠的心肌组织细胞膜色谱系统和衰竭大鼠的心肌组织细胞膜色谱系统,比较附子提取液在两者之间保留行为差异,从附子中成功筛选出16种心肌细胞膜结合成分和3种专属性的抗心衰活性成分,比较全二维色谱图谱如图5所示。Wu等建立全二维K/CMC/C18柱/TOF-MS系统筛选青黛中抗白血病活性成分。Wang等建立SMMC-/CMC和HepG2/CMC18柱/TOF-MS系统,成功地对一系列人工合成的VEGFR抑制剂的活性进行排序。考虑到在生物体内的靶组织上实际起作用的活性成分不一定是小分子,也有可能是其代谢产物,全二维细胞膜色谱不仅可应用于筛选中药提取液中潜在活性成分,也适用于中药体内代谢产物的筛选。Jia等建立了全二维HepG2肝癌/CMC/C18柱/TOF-MS分析系统,筛选口服黄芩提取液后的大鼠血清中抗肝癌活性成分。全二维分析系统通量高,准确性、专属性、适用性良好,极大提高了细胞膜色谱技术的分辨能力,且TOF-MS可提供每一个活性组分的精确质量信息和丰富的离子碎片信息,在没有标准品的条件下也可以获得可信的化合物鉴别分析结果,因此十分适用于中药等天然药物的复杂体系中有效的活性成分的筛选。
图4全二维细胞膜色谱分析系统示意图:
(A)十通阀处于位置1;(B)十通阀处于位置
图5正常/阿霉素诱导心衰比较全二维CMC/整体柱/TOF-MS方法筛选附子中抗阿霉素诱导的心力衰竭的活性成分三维色谱图:
(A)正常心肌细胞膜色谱;(B)衰竭心肌细胞膜色谱
4细胞膜色谱技术在中药活性成分筛选中的应用中药及天然药物中成分繁多且复杂,如何快速鉴定其中的活性组分一直是中药药效物质基础研究的难题。随着细胞膜色谱分析系统的快速发展,细胞膜色谱法从中药及天然药物中筛选有效活性成分的应用越来越广泛。此外,二维细胞膜色谱系统具有方法快速、操作简捷、稳定可靠等特点,越来越多地应用于中药复杂体系活性成分的筛选。表1中列出了近年细胞膜色谱用于中药活性成分筛选的应用研究的统计和概述。
表1细胞膜色谱法应用于筛选中药中活性成分的研究
5总结和展望细胞膜色谱技术经历了二十余年的发展,多个课题组对细胞膜色谱制备方法学进行了全面的考察和研究,其制备过程得到不断的完善和优化。重要的是,细胞膜色谱分析系统从最开始的单维细胞膜色谱分析系统,发展到“中心切割”二维细胞膜色谱分析系统,再到全二维细胞膜色谱分析系统,从离线发展到在线,不断减少分析步骤、缩短分析时间,提高了准确性和通量。大量研究表明,新型细胞膜色谱制备技术结合全二维色谱串联高分辨质谱技术非常适用于复杂体系中活性成分的筛选。然而,在细胞膜色谱系统中,为了保证分析的有效性,通常需要大量细胞(约3×个)进行色谱柱的制备,无法适用于原代细胞等难以获得或扩增的珍稀细胞系。Tang等尝试将细胞膜色谱搭载于在石英毛细管上,建立了毛细管细胞膜色谱,并应用于筛选天然产物中活性成分;Zhang等首次建立了开放管状毛细管细胞膜色谱,具有与普通CMC相似的色谱保留因子和稳定性,但细胞膜消耗量比CMC低数百倍。然而,这类开管的毛细管细胞膜色谱存在均一性低、无法与二维色谱、质谱在线串联等问题。因此,建立基于微型/nano色谱柱的细胞膜色谱多维分析系统是细胞膜色谱方法学发展的趋势。同时,微型/nano色谱具有灵敏度高、细胞用量少、可阵列化等优点,使得细胞膜色谱在高通量药物-受体相互作用表征和化学生物学等领域展现出良好的应用前景。细胞膜色谱技术作为一种兼有色谱分离和活性筛选双重特性的药物活性分析方法,未来将向集成化、微型化、阵列化和自动化的方向快速发展。
天士力之骄赞赏
