北京治疗白癜风最好的医院 http://m.39.net/pf/bdfyy/汇报人：LuYinLab研究生二年级宋莉
ACSNANO/使用3D肝脏芯片研究细胞外囊泡在乳腺癌肝脏转移中的作用研究背景乳腺癌是全球女性发病率最高的癌症，是威胁女性身心健康的一大杀手。随着科学技术水平的发展，乳腺癌患者的生存率也逐年升高。没有出现转移的原位乳腺癌患者的五年生存率高达99%，而转移患者生存率仅有24%，由此可见乳腺癌的转移极为致命。脑、骨、肺和肝脏是乳腺癌转移的常发部位，肝脏作为人体最大的腺体，乳腺癌的肝转移预后最差。细胞外囊泡（extracellularvesicles,EVs）是一种由细胞释放到细胞外基质的纳米级膜性小囊泡，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程，广泛地存在于各种体液和细胞上清中，并稳定携带了一些重要的信号分子。在肿瘤微环境中，EVs是肿瘤细胞与其他细胞信息交换的桥梁。大量研究表明，肿瘤细胞分泌的EVs可促进肿瘤的侵袭、血管生成、抑制肿瘤免疫，对肿瘤的发展有着不利影响。目前大部分关于EVs的研究都集中在其与肿瘤细胞之间的相互作用，但对于EVs如何影响肿瘤转移部位的微环境，研究却比较少。基于以上背景，作者利用微流控技术构建了能够模拟人体肝脏生理环境的3D芯片，来研究EVs在乳腺癌肝转移过程当中的作用。本文Three-DimensionalHumanLiver-ChipEmulatingPremetastaticNicheFormationbyBreastCancer-DerivedExtracellularVesicles于年8月份发表在ACSNANO上，影响因子14.。由韩国国立蔚山科技大学的JunyoungKim和Yoon-KyoungCho教授分别担任一作和通讯。Result1:MicrofluidicHumanLiver-ChipRecapitulatestheInVivoLiverMicroenvironment.
肝窦内皮细胞构成肝脏的血管结构，其周围是肝细胞，中间的窦周隙还含有肝星状细胞、成纤维细胞等。一旦肿瘤细胞突破肝窦内皮细胞入侵到肝细胞中并在此定植，则发生肝转移。基于肝脏的这种结构，作者构建了能够模拟肝生理环境的3D微流控芯片。该芯片分为上下两个通道，上通道由肝窦内皮细胞（liversinusoidalendothelialcells，LSECs）单层构成，用以模拟血管结构；下通道则由细胞外基质、肝纤维细胞及底部的肝细胞构成。上下通道由一层多孔膜隔开。首先用纤连蛋白包被芯片以利于细胞在芯片上的黏附。将这几种细胞置于芯片中培养直至稳定，随后即可在上通道中通入肿瘤细胞及其分泌的EVs进行后续实验研究。
在开始实验之前，作者对芯片中三种细胞的活力进行了分析，发现随着时间的增加，他们的细胞活力均无显著变化。此外，相较于单独培养的肝细胞，芯片中肝细胞白蛋白的分泌量及尿素的合成量更高，证明该芯片能较好地模拟肝的生理环境。
Result2:BreastCancer-DerivedEVsActivateLSECsintheLiverMicroenvironment.EVs在乳腺癌的肝转过程中扮演着什么样的角色呢？作者取细胞的条件培养基（conditionedmedium,CM）,通过离心、0.25μm微孔滤膜过滤,之后再用配备有20nm孔径过滤器的离心盘离心的方法，分离制备了正常乳腺细胞MCF10A及两种乳腺癌细胞MDA-MB-和MCF-7来源的EVs（20-nm）。使用纳米粒子跟踪分析技术（NTA）和扫描电镜对其粒径大小进行验证，并对EVs和细胞裂解液（celllysate，CL）进行WB分析验证其纯度。接着，作者向芯片的上通道中通入不同细胞来源的EVs，处理24h后，检测其对LSECs的影响。免疫荧光结果显示，MCF10A分泌的EVs（M10AEVs）对LSECs细胞间紧密连接蛋白ZO-1的表达无影响，而MDA-MB-和MCF-7来源的EVs（MDAEVs、M7EVs）可显著破环内皮细胞的紧密连接。此外，MDAEVs和M7EVs还显著提高了间充质细胞标志物波形蛋白（Vimentin）和癌症相关成纤维细胞标志物FAP-α和α-SMA在LSECs中的表达。
由于EVs粒径较小，可自由穿过上下通道之间的多孔膜，与下通道内肝细胞和成纤维细胞直接接触，于是作者使用流式分析了MDAEVs处理芯片一天后，肝细胞和成纤维细胞的特征变化，发现MDAEVs可显著改变肝细胞中肝损伤标志物AFP及成纤维细胞中Vimentin、FAP-α、α-SMA和纤连蛋白（Fibronectin）的表达。以上结果表明乳腺癌EVs可破坏LSECs细胞间的紧密连接，诱导肝细胞损伤，促进上皮间质转化，创造有利于肝转移的微环境。
Result3:BreastCancer-DerivedEVsIncreaseBreastCancerCellAdhesionintheLiverMicroenvironment.肿瘤细胞在内皮细胞上的黏附是其发生侵袭转移的关键步骤，于是作者进一步研究了EVs能否影响乳腺癌细胞在LSECs上的黏附。使用EVs处理芯片24h，随后通入肿瘤细胞。结果显示M10AEVs不影响乳腺癌细胞在内皮细胞上的黏附，而MDAEVs和M7EVs则分别使MDA-MB-和MCF-7在内皮细胞上的黏附显著增加，且呈浓度依赖性。此外，乳腺癌细胞分泌的其他可溶性因子以及LSECs对EVs的摄取均可促进乳腺癌细胞在LSECs上的黏附。那么乳腺癌细胞在肝脏上的粘附是否是因为肝脏微环境产生了某些特殊的信号？作者分别使用几乎无肝脏转移的胶质母细胞瘤U-87MG和两种肝转移能力强的胰腺癌细胞PANC-1和Capan-1进行验证，发现EVs可促进MDA、PANC-1和Capan-1在肝脏芯片上的粘附，对U-87MG的黏附却无影响。此外，作者还使用人脐静脉内皮细胞HUVEC取代芯片中的LSECs，但EVs并没有增强MDA在HUVEC上的黏附，表明肿瘤细胞在肝脏上的黏附不仅取决于肿瘤细胞的类型，也依赖于肝脏特异性的微环境。接着作者验证了肿瘤细胞在肝脏上的黏附是否会导致转移的发生。结果显示随着时间的增加，LSECs上黏附的肿瘤细胞越来越多，侵袭率也越来越高，说明肿瘤细胞在肝脏上的黏附可间接反映出其侵袭能力。以上结果表明乳腺癌EVs可破坏肝内皮屏障，促进肝微环境中的上皮间质转化并损伤肝细胞，从而促进肿瘤细胞的粘附和侵袭。Result4:TGFβ1inBreastCancer-DerivedEVsIncreaseTumorAdhesionintheLiverMicroenvironment.TGFβ是各器官肿瘤发生和发展的重要信号通路，同时也是上皮间质转化过程中的重要因子，TGFβ1可由EVs转运，于是作者猜测TGFβ1是否会在肿瘤细胞的黏附过程中发挥重要作用。作者使用ELISA检测了不同细胞CL以及EVs中TGFβ1的含量，发现相较于CL，EVs中TGFβ1的表达明显更高，且乳腺癌细胞TGFβ1的含量显著高于MCF10A。使用shRNA敲低细胞中TGFβ1的表达后，CL和EVs中TGFβ1的含量均显著降低。另外，作者还使用了TGFβ1中和抗体处理EVs，发现无论是中和掉还是敲低TGFβ1的表达，均可显著降低MDA-MB-和MCF-7在肝脏上的黏附。Result5:TGFβ1-ContainingEVsIncreasesBreastCancerCellAdhesionbyUpregulatingFibronectininLSECs.有研究表明，肝脏微环境中的LSECs通过上调VCAM-1和ICAM-1等各种细胞粘附分子（CAM）促进肿瘤细胞在肝脏上的粘附，其中纤连蛋白在细胞黏附中起到重要作用。免疫荧光结果显示，敲低乳腺癌细胞TGFβ1的表达或使用TGFβ1中和抗体处理过的乳腺癌EVs均可显著降低LSECs中纤连蛋白表达，同时降低乳腺癌细胞在肝脏芯片上的黏附。Result6:EVsfromtheBloodofBreastCancerPatientswithLiverMetastasesContainsHigherTGFβ1LevelsandIncreasedAdhesionofBreastCancerCellstothe3DHumanLiver-Chip.最后，作者分离了乳腺癌患者血浆中的EVs进行分析，包括6例肝转移性（LM）、7例非转移性（NM），共13例三阴性乳腺癌（TNBC）患者和8例健康志愿者（HD）。结果显示乳腺癌患者体内EVs的浓度显著高于健康志愿者，同时肝转移性患者EVs中TGFβ1的表达显著高于另外两组患者。将分离得到的EVs放入芯片中处理24h，发现乳腺癌患者的EVs可显著促进MDA-MB-细胞在肝脏中的黏附，其中肝转移性患者组细胞的黏附最强。这说明EVs中TGFβ1的表达与乳腺癌的肝转移密切相关。总结与讨论本篇文章利用能够模拟人体肝脏生理环境的3D微流控芯片，发现乳腺癌EVs可破坏LSECs细胞间紧密连接、促进上皮间质转化、诱导肝细胞损伤，从而形成有利于乳腺癌肝转移的微环境；乳腺癌EVs中的TGFβ1通过上调LSECs表面纤连蛋白，促进乳腺癌细胞在肝脏中的黏附及侵袭。作者还使用乳腺癌患者血浆中的EVs进行了验证。这篇文章的创新之处在于3D肝脏芯片的构建，为研究肿瘤转移提供了有力工具；思路清晰、结果直观，但机制研究还不够深入。参考文献
1.MayerJE,MaurerMA,NguyenHT.Diffusecutaneousbreastcancermetastasesresemblingsubcutaneousnoduleswithnosurfacechanges[J].Cutis,,(3):.
2.KimbungS,JohanssonI,DanielssonA,etal.Transcriptionalprofilingofbreastcancermetastasesidentifieslivermetastasis-selectivegenesassociatedwithadverseout
